863中心丨转基因荧光斑马鱼助力舒缓功效评价

在当今快节奏的生活中，肌肤面临着前所未有的压力与挑战，环境污染、紫外线辐射、工作压力以及日常护肤不当等因素，都可能导致肌肤敏感、泛红、紧绷甚至刺痛。因此，化妆品市场中，拥有舒缓功效的产品日益受到消费者的青睐。这些产品通过精心配比的天然成分，如植物提取物、矿物质及温和保湿因子，旨在深层滋养肌肤，缓解肌肤不适，恢复肌肤的自然平衡与健康状态。因此选择一款合适的舒缓化妆品，不仅是对肌肤的温柔呵护，更是现代生活中不可或缺的一份宁静与放松。但一款优秀的舒缓化妆品往往因敏感与刺激的引发的多维度性、复杂性与个体皮肤差异性而难以自证，现863中心推出一种通过荧光标记中性粒细胞追踪炎症部位方法评价化妆品舒缓功效，助力化妆品舒缓宣称。

一、检测原理

炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞（粒细胞、巨噬细胞）会聚集在感染组织周围。斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达。数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。十二烷基磺酸钠（SLS）能诱发表皮炎症细胞浸润，导致皮肤出现红斑、瘙痒、疼痛等症状。SLS暴露于斑马鱼皮肤表面，同样能诱导炎症反应，导致中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表面增殖和迁移。使用转基因中性粒细胞绿色荧光品系斑马鱼进行实验，通过图像分析方法可对中性粒细胞进行计数，从而评价化妆品舒缓功效。

二、测试文件

自2021年1月1日《化妆品监督管理条例》正式实施以来，4月9日，《化妆品功效宣称评价规范》《化妆品安全评估技术导则（2021年版）》又相继发布，这意味着，中国化妆品行业正式进入了功效宣称评价、安全评估时代。

新的化妆品检测与评价技术的研究开发，对于新规下化妆品行业的发展至关重要。目前，浙江省健康产品化妆品行业协会发布了《化妆品舒缓功效评价 斑马鱼幼鱼中性粒细胞抑制率法》T/ZHCA 016—2022，进一步推动了斑马鱼检测方法成为一种新兴的化妆品检测替代性实验方法。

三、具体内容介绍

//3.1定义

受精后天数（day post-fertilization；dpf）：斑马鱼受精卵受精后的天数。

最大耐受浓度（maximum tolerated concentration；MTC）：3 dpf的斑马鱼幼鱼未出现任何死亡（无心跳）和其他毒性效应（心包水肿、躯干弯曲、对机械刺激无反应、肌肉纹理不清晰等）的最高浓度。

//3.2受试物

造模剂：60μg/mL十二烷基磺酸钠，参考《化妆品舒缓功效评价 斑马鱼幼鱼中性粒细胞抑制率法》T/ZHCA 016—2022配制。

阳性对照：参考《化妆品舒缓功效评价 斑马鱼幼鱼中性粒细胞抑制率法》T/ZHCA 016—2022配制。

//3.3适用范围

适用于化妆品及其原料（仅适用于能溶于水或能均匀分散成悬浮水溶液的受试物），用于评价化妆品舒缓功效。

//3.4斑马鱼品系

选用转基因中性粒细胞绿色荧光品系斑马鱼的幼鱼[Tg（mpx：EGFP）]。

//3.5养殖要求

①养殖水温宜控制在26～28.5℃，室内温度建议控制在20～25℃。

②养殖密度宜控制在每升水1～2条鱼，以及每日固定的12～16h光照，且需保持良好的过滤系统。

③每天至少喂食2次，包括至少1次丰年虾（Artemia salina）幼虫，喂食间隔在3小时以上，避免过量喂食影响水质和清洁度。

//3.6试验流程

①挑选发育正常的2dpf斑马鱼作为试验对象。

②将斑马鱼转入六孔细胞板依次添加含有造模剂的受试物溶液避光孵育。

③孵育结束后固定斑马鱼并在荧光显微镜下拍照。

④应用图像分析软件分析图片并计量中性粒细胞数量。

红色虚线包围部分为中性粒细胞数量测量区域

//3.7结果计算

红色小点为软件判断的中性粒细胞

//3.8试验有效性条件

① 空白对照组与模型对照组的之间的中性粒细胞个数存在统计学上的显著性差异，且平均值之差必须大于2倍的空白对照组组内标准偏差（SD），否则该次试验视为失败。

② 阳性对照组与模型对照组之间的中性粒细胞个数存在统计学上的显著性差异，且平均值之差必须大于2倍的模型对照组组内标准偏差（SD），否则该次试验视为失败。

③ 孵育结束后固定斑马鱼并在荧光显微镜下拍照。

//3.9试验仪器

① 荧光体视显微镜，配带显微拍照系统。

荧光体视显微镜

② 分析天平，精度大于等于0.1mg。

③ 生化培养箱，温度控制范围5℃~50℃，温度精度±0.1℃

④ 斑马鱼养殖设备，需配有温控装置，水循环和过滤装置，养殖容器用玻璃或常见食品级PC材质制成。

//3.10结果评价

在试验满足有效性的基础上，受试物中性粒细胞个数与模型对照组相比有统计学上的显著性差异，即P<0.05，说明受试物在该浓度下能够抑制中性粒细胞的增殖和迁移，可作为舒缓功效评价的证据支撑之一。

四、样例介绍

//4.1各测试组别样例显示

空白对照组 >>

模型对照组 >>

受试物组 >>

某一受试物舒缓功效检测结果

//4.2结果分析

如上图所示，荧光绿色部分即为斑马鱼体内中性粒细胞，受试物的舒缓功效越好，则斑马鱼体内荧光绿色部分越小，中性粒细胞个数越少。由上图可知受试物组中性粒细胞数与模型对照组中性粒细胞数相比具有统计学差异（P<0.05），测试结果可作为受试物具有舒缓功效的支持证据。

五、关于斑马鱼检测

① 非动物：鱼胚胎检测方法属于非动物测试，符合全球关于动物替代测试发展趋势。

② 高通量：具有高通量优势，可快速低成本完成更多检测项目，如原料功效研究，原料筛查，配方甄选等。

③ 可视化：检测方法具有可视化优势，可让消费者直观感知产品的品质。

④ 高效率：与传统检测机构相比，斑马鱼检测更全面，能快速得到检测结果。

⑤ 低成本：相比人体临床或动物实验，斑马鱼检测成本相对较低。

863中心-斑马鱼实验室Zebrafish Laboratory

863中心具有丰富的化妆品及化妆品原料检测经验，已取得化妆品毒理学试验相关检测资质，形成了集化妆品微生物检验、理化检验、毒理学试验和人体安全性检验及功效评价等多方位检测服务链，全面覆盖化妆品原料及产品的注册和备案检验的各个方面，具有完善的服务内容和服务网络，能为客户提供专业的咨询和测试服务。