标准解读丨化妆品紧致功效评价斑马鱼幼鱼弹性蛋白基因相对表达量法

试验产品：

紧致化妆品

阳性对照：

20mg/mL肌肽 L-Carnosine，CAS：305-84-0，纯度≥98%，参考《化妆品紧致功效评价斑马鱼幼鱼弹性蛋白基因相对表达量法》T/ZHCA 015-2022 5.4 配制。

仅适用于能溶解于水或能均匀分散成悬浮水溶液的化妆品及其原料进行化妆品紧致功效评价。

选用野生型AB品系斑马鱼幼鱼

斑马鱼幼鱼置于六孔细胞培养板中并用铝箔纸包裹培养板面板，在（28.5±1.0℃）生化培养箱中避光孵育24h。

① 预试验，用于确定受试物的MTC，为正式试验的浓度设置提供参考。

② 受试物处理，选取发育正常4dpf斑马鱼幼鱼置于孔板中，添加3mL受试物。

③ 到孵育终点后（5dpf）将斑马鱼清洗转移至离心管，用吸水纸吸干水分并保存至-80℃。

④ 按RNA快速提取试剂盒操作说明书进行总RNA提取，后用超微量紫外分光光度计对总RNA浓度进行测定，要求各测试组在260nm和280nm处的吸光度比值位于1.90-2.20之间。

⑤ 将总RNA建立反转录体系，按反转录试剂盒说明书合成cDNA。

⑥ 按SYBR Green 荧光染料试剂盒说明书设置qPCR反应程序，进行基因扩增。根据不同测试组到达扩增阈值的循环数，计算循环数之差，表征弹性蛋白基因相对表达量。

① 预试验及正式试验中，空白对照组中斑马鱼幼鱼死亡率或异常率不得超过10%。

② 正式试验中，阳性对照组相对表达量应大于空白对照组并存在统计学上的显著性差异，且平均值之差必须大于2倍的空白对照组组内标准偏差（SD）。

③ 正式试验中，如果使用了助溶剂，溶剂对照组与空白对照组之间的基因相对表达量就不能存在统计学上的显著性差异。

根据预试验的结果，确定正式试验的受试物浓度范围，试验最高浓度组不得高于 MTC。根据测试需要，将受试物储备液用标准稀释水以2倍几何级数稀释至3~5个浓度系列。

算各组试验的平均值（Mean）及标准误差（Standard Error，SE），统计学处理结果用Mean±SE表示。使用SPSS等统计学软件对数据进行方差分析，以空白对照组（或溶剂对照组）作为标准，比较各实验组目的基因相对表达量，P<0.05 表示有显著性差异。

在试验满足有效性的基础上,受试物与空白/溶剂对照相比,如果eln1、eln2的相对表达量显增加(P<0.05),说明受试物在该浓度下具有增加弹性蛋白基因(eln1、eln2)相对表达量的能力,可作为紧致功效评价的证据支撑之一。